Изобретение относится к технической микробиологии и может быть использовано в нефтяной промышленности при исследованиях нефтепромысловых сред на содержание в них сульфатвосстанавливающих бактерий (СВБ) и подбора бактерицида для подавления роста СВБ. Набор для выявления роста СВБ и подбора бактерицида для подавления роста СВБ содержит стерильные флаконы для отбора проб и с питательной средой, снабженные стерильными резиновыми пробками, шприц для дозированного отбора или ввода исследуемой среды, емкость с этиловым спиртом, вату и упаковку с универсальной индикаторной бумагой для определения рН среды, флаконы дополнительно снабжены поверх резиновых пробок колпачками из алюминиевой фольги для повышения стерильности и удобства хранения, которые закреплены на флаконах кремпером, причем набор дополнительно содержит флакон с раствором щелочи и флакон с раствором соляной кислоты для создания нейтральной среды и карандаш для маркировки флаконов. Набор содержит стерильные флаконы с питательной средой по 9 мл в каждом флаконе и шприцы объемом 1 мл от 100 до 1000 штук. Набор позволяет быстро и качественно выявить СВБ как в лабораторных, так и в нефтепромысловых условиях. 1 з. п. ф-лы, 2 табл.
Изобретение относится к технической микробиологии и может быть использовано в нефтяной промышленности при исследовании нефтепромысловых сред на содержание в них сульфатвосстанавливающих бактерий (СВБ) и подбора бактерицидов для подавления роста СВБ.
При выполнении любой методики количественного определения веществ необходимо приготовление исходных реагентов или устройств для дальнейшего проведения серии последовательных операций в соответствии с методикой. Приготовление исходных реагентов требует точности измерений количества входящих компонентов, условий стерильности и высокой квалификации от исполнителей. Поэтому для многих используемых методик соответствующие исходные реагенты или устройства изготавливают в специализированных лабораториях и продают в виде наборов.
Известен набор для определения первичных ароматических аминов в растворах и биологических жидкостях, включающий 4 флакона с различными химреагентами и 1 флакон с полосками хроматографической бумаги (патент РФ 2097762, МКИ G 01 N 33/48, публ. 1997 г.).
Известен набор для измерения концентрации анализируемого вещества в биологических жидкостях, содержащий прибор для измерения концентрации анализируемого вещества в образце биологической жидкости, которая наносится на поверхность пористой мембраны с анализируемым веществом, и удлиненный контейнер для содержания множества устройств (заявка РФ 97113750, МКИ G 01 N 33/48, публ. 1998 г.).
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является набор, включающий стерильные флаконы для отбора проб и с питательной средой, снабженные стерильными резиновыми пробками, шприц для дозированного отбора или ввода исследуемой среды, емкость с этиловым спиртом, вату и упаковку с универсальной индикаторной бумагой для определения рН среды. Известный набор используется для проведения методики контроля микробиологической зараженности нефтепромысловых вод и оценки защитного и бактерицидного действия реагентов (РД 39-3-973-83. Министерство нефтяной промышленности. ВНИИСПТнефть, 1984 г. , с. 6). Для применения данной методики лаборатория должна быть оснащена необходимыми материалами и оборудованием. Также для проведения данной методики требуются питательные среды, содержащие разнообразные соли и добавки. Приготовление питательных сред, их фасовка во флаконы и обеспечение герметичности закупорки флаконов требует создания условий стерильности. Такой возможностью обладают лишь хорошо оснащенные лаборатории с квалифицированными сотрудниками. Поэтому для выявления СВБ и подбора бактерицида для подавления роста СВБ необходимо промысловую жидкость везти в лабораторию для проведения анализов, что значительно снижает эффективность исследований, приводит к удорожанию и требует затраты времени.
В основу настоящего изобретения положена задача создания набора для выявления СВБ и подбора бактерицида для подавления роста СВБ, позволяющая определить степень зараженности нефтепромысловых вод СВБ, а также оценить защитное действие бактерицидов против микробиологической коррозии.
Поставленная задача решается путем создания набора для выявления СВБ и подбора бактерицида для подавления роста СВБ, содержащего стерильные флаконы для отбора проб и с питательной средой, снабженные стерильными резиновыми пробками, шприц для дозированного отбора или ввода исследуемой среды, емкость с этиловым спиртом, вату и упаковку с универсальной индикаторной бумагой для определения рН среды, флаконы дополнительно снабжены поверх резиновых пробок колпачками из алюминиевой фольги для повышения стерильности и удобства хранения, которые закреплены на флаконах кремпером, причем набор дополнительно содержит флакон с раствором щелочи и флакон с раствором соляной кислоты для создания нейтральной среды и карандаш для маркировки флаконов.
Комплектование такого набора позволяет использовать его как в лабораторных условиях, так и непосредственно на месте отбора нефтепромысловой жидкости, эффективно провести исследования и подобрать бактерицид применительно к данным пластовым условиям. Набор компактен, удобен для перевозки.
Флаконы с питательной средой готовят заранее по утвержденной методике. Наиболее благоприятной средой для выявления СВБ, накопления и поддержания с целью сохранения жизнеспособности клеток является среда Постгейта, содержащая разнообразные соли, которые растворяют в 1 литре водопроводной воды и стерилизуют. После стерилизации основной раствор питательной среды обескислороживают кипячением и последующим быстрым охлаждением под струей водопроводной воды. Затем вводят добавки с соблюдением правил стерильности. Затем простерилизованную питательную среду разливают пипеткой в количестве 9 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают стерильной резиновой пробкой и колпачками из алюминиевой фольги, которые закрепляют на флаконах кремпером. Готовые флаконы стерилизуют в автоклаве при температуре 121oС в течение 20 минут. После остывания флаконы с питательной средой готовы для проведения исследований. Оптимальной для роста СВБ является рН, равная 7,0-7,2. Для определения рН среды используют универсальную индикаторную бумагу. Если рН среды изменилась в сторону подкисления или подщелачивания, то используют соответственно 5% раствор NaHCO3 или 1% раствор НСl, которые вводят во флаконы в количестве 0,01 мл. Для проведения качественных исследований набор содержит от 100 до 1000 флаконов с питательной средой. К каждому флакону прикладывается стерильный шприц объемом 1 мл.
Вначале отбирают пробы исследуемой нефтепромысловой жидкости в пустые стерильные флаконы. Шприцем отбирают 1 мл исследуемой жидкости и вводят во флаконы с питательной средой. Флакон встряхивают, затем из него отбирают 1 мл жидкости и вводят во 2-й флакон с питательной средой. Обычно для обработки 1 пробы исследуемой жидкости используют 14-20 флаконов и соответственно 14-20 шприцев. Таким образом ведут посев до заполнения всех флаконов. Посев каждой пробы проводят не менее чем в 2-х повторениях. После окончания посева на флаконах делают запись с указанием времени и места отбора проб.
Посевные флаконы выдерживают в течение 15 суток при температуре 30-32oС. Рост и развитие клеток СВБ сопровождается образованием сероводорода и хорошо видимого черного осадка — сульфида железа. Количество клеток СВБ в исходной пробе оценивают по последнему флакону, в котором наблюдают рост СВБ — образование черного осадка. Считают, что в последнем флаконе с черным осадком первоначально присутствовала 1 бактериальная клетка.
Количество бактерий в 1 мл исходной пробы воды рассчитывают по формуле M=10П/V; где М — количество бактериальных клеток, содержащихся в 1 мл исходной пробы; 10 — коэффициент разведения; П — порядковый номер последнего разведения (флакона), где наблюдался рост бактерий; V — объем взятой для посева воды (1 мл).
Подбор бактерицида для подавления роста СВБ проводят в 2 этапа — на выделенной накопительной культуре и на промысловой воде следующим образом. В ряд флаконов с питательной средой дозируют шприцем раствор испытуемого реагента — бактерицида с таким расчетом, чтобы его концентрация в пересчете на объем флакона составляла: 250, 200, 150, 100, 50, 25 мг/л. Флакон с выращенной культурой СВБ встряхивают, выдерживают до оседания осадка и отбирают шприцем 0,5 мл надосадочной жидкости и вводят во флаконы с питательной средой и бактерицидами. Флаконы перемешивают, маркируют и выдерживают при температуре 30-32oС в течение 15 суток. Для каждой концентрации бактерицида проводят три параллельных испытания. Два флакона без добавки бактерицида служат контрольной пробой. По истечении 15 суток эффективными считаются те реагенты, которые не дают потемнения или слегка окрашенные.
Реагенты, показавшие положительный эффект, испытывают на промысловой воде, зараженной СВБ.
Промысловую жидкость отбирают в стерильные флаконы, быстро дозируют определенное количество реагента и выдерживают от 2-х до 24 часов при температуре 30-32oС. Затем стерильным шприцом отбирают 1-2 мл пробы и вводят во флаконы с питательной средой. Проводят 3 параллельных опыта. Через 15 суток определяют содержание сероводорода в опытных и контрольных пробах.
Эффективность подавления СВБ рассчитывают по формуле S=(C-C1)/C
100%, где С — содержание сероводорода в контрольной пробе, мг/л; C1 — содержание сероводорода в исследуемой пробе, мг/л.
Новая совокупность заявленных существенных признаков позволяет получить новый технический результат, а именно готовить наборы для выявления СВБ и подбора бактерицида для подавления роста СВБ, позволяющие быстро и качественно провести исследования непосредственно в нефтепромысловых условиях.
Анализ известных технических решений, отобранных в процессе поиска, показал, что в науке и технике нет объекта, обладающего заявленной совокупностью признаков и наличием преимуществ, что позволяет сделать вывод о соответствии заявленного объекта критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Для доказательства соответствия заявляемого изобретения приводим конкретные примеры использования набора для выявления СВБ и подбора бактерицида для подавления роста СВБ.
Приводим пример выявления СВБ в пластовой жидкости.
Отбирают пробу пластовой жидкости в стерильный флакон из скв. 18811 Павловской площади Ромашкинского месторождения. Шприцем отбирают 1 мл пластовой жидкости и вводят в флакон с питательной средой, разведение 1:10. Встряхивают этот флакон, отбирают 1 мл жидкости и вводят во 2-й флакон с питательной средой, разведение 1:100. Таким образом делают 5 разведении (1: 100000). При каждом разведении используют по 3 флакона с питательной средой. Делают соответствующие записи на флаконах. Засеянные флаконы выдерживают при температуре 30-32oС в течение 15 суток. Определяют количество бактерий в 1 мл пластовой жидкости.
Количество клеток СВБ в пластовой жидкости рассчитывают по последнему флакону, в котором наблюдался рост СВБ — среда окрасилась в темный цвет. В наших исследованиях окрашивание среды было в последний раз при 3-м разведении. Подсчитываем количество СВБ в 1 мл пластовой жидкости по формуле М=10
Таким образом, в 1 мл пластовой жидкости содержится 103 клеток СВБ (табл. 1, опыт 3).
Приводим примеры по оценке защитного действия бактерицидов Сульфан и СНПХ-1002 для подавления роста СВБ в промысловых условиях.
В стерильные флаконы отбирают пробы пластовой жидкости из систем ППД НГДУ «Альметьевнефть». Во флаконы с питательной средой дозируют шприцем бактерицид Сульфан с концентрацией, которая в пересчете на объем флакона составляет 25, 50 и 100 мг/л. Далее флаконы выдерживают от 2 до 24 часов при температуре 30-32oС. Затем шприцем отбирают из флакона 1 мл пробы и вводят во флакон с питательной средой. Для каждой концентрации бактерицида проводят 3 параллельных опыта. Флаконы выдерживают при температуре 30-32oС в течение 15 суток. Далее определяют содержание сероводорода в опытных и контрольных флаконах. Рассчитывают степень подавления СВБ по формуле S=(С-C1)/С
Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, только в качестве бактерицида берут бактерицид СНПХ-1002. Рассчитывают степень подавления СВБ по формуле S=(С-C1)/C
Как видно из данных таблицы 2, наиболее эффективным для подавления роста СВБ в пластовой жидкости данного месторождения является бактерицид Сульфан по ТУ 2458-003-42147065-ОП-99 с концентрацией 50 мг/л, который на 100% подавляет рост СВБ.
Применение заявляемого изобретения позволяет быстро и качественно выявить наличие СВБ в промысловой жидкости и подобрать наиболее эффективный бактерицид для подавления роста СВБ как в лабораторных условиях, так и непосредственно в нефтепромысловых условиях.
1. Набор для выявления сульфатвосстанавливающих бактерий и подбора бактерицида для подавления роста сульфатвосстанавливающих бактерий, содержащий: стерильные флаконы для отбора проб и с питательной средой Постгейта, снабженные стерильными резиновыми пробками, шприц для дозированного отбора или ввода исследуемой среды, емкость с этиловым спиртом, вату и упаковку с универсальной индикаторной бумагой для определения рН среды, отличающийся тем, что флаконы дополнительно снабжены поверх резиновых пробок колпачками из алюминиевой фольги для повышения стерильности и удобства хранения, которые закреплены на флаконах кремпером, причем набор дополнительно содержит флакон с раствором щелочи и флакон с раствором соляной кислоты для создания нейтральной среды и карандаш для маркировки флаконов.
2. Набор по п.1, отличающийся тем, что стерильных флаконов с питательной средой по 9 мл в каждом флаконе и шприцев объемом 1 мл он содержит от 100 до 1000 шт.
Рисунок 1 – Круговорот азота в природе
Рисунок 2 – Цикл превращения серы:
восстановительные процессы без перемены валентности серы окислительные процессы
1 – бесцветные серобактерии, тионовые (в аэробных условиях) и фотосинтезирующие серные бактерии (в анаэробных условиях); 2, 3 — тионовые бактерии, архебактерии; 4 – все микроорганизмы и растения (ассимиляция); 5 – сульфатредуцирующие бактерии;
6 – термоацидофильные анаэробные бактерии;
7 – облигатно анаэробные термофильные клостридии
, биогенный элемент, содержится в белках в форме аминокислот, входит в состав молекул витаминов, коферментов. В природе сера претерпевает разнообразные химические и биологические превращения, переходя из неорганических соединений в органические и обратно. При разложении остатков животных, растений, микроорганизмов освобождаются серосодержащие аминокислоты, тиоспирты, тиофенолы, тиоэфиры, гетероциклические соединения, в которых сера находится в восстановленном состоянии. В цикле превращения серы участвуют разнообразные группы микроорганизмов(бактерии и архебактерии, аэробные и анаэробные, хемо- и фототрофы — рисунок 2).
аэробных условиях окислительные процессы серы и ее восстановленных неорганических и органических соединений осуществляют хемоавтотрофные прокариоты (серные, тионовые бактерии), а также некоторые типичные гетеротрофные бактерии родов и др.
анаэробных процессах участвуют фототрофные серные пурпурные и зеленые бактерии, осуществляющие бескислородный фотосинтез.
При ассимиляции сульфатов, как источника серы, происходит восстановление серы в процессах конструктивного метаболизма– ассимиляционная сульфатредукция. Биологическое закрепление растворимых сульфатов в микробных клетках называется также иммобилизацией серы.
анаэробных условиях сульфаты восстанавливаются до сероводорода узкоспециализированной группой облигатных анаэробов сульфатредуцирующих
бактерий в процессе анаэробного дыхания.
Восстановление и до осуществляют облигатно анаэробные
термофильные бактерии p.Clostridium.
В восстановлении молекулярной серы доHS участвуют многие термоацидофильные строго анаэробные архебактерии.
При разложении белковых веществ(обычно этот процесс называется гниением) выделяется сероводород и ряд других летучих дурнопахнущих продуктов. Гнилостные микроорганизмы – это аэробные и анаэробные микроорганизмы родов и . Процессы восстановительных звеньев цикла серы тесно сопряжены с окислительными, и часто сульфатредуцирующие бактерии развиваются в общих местообитаниях с серными, которые окисляют сероводород, поступающий из анаэробной зоны.
Накопительные культуры микроорганизмов
(методы получения и исследования)
В условиях естественного обитания чистые культуры микроорганизмов встречаются крайне редко. В то же время основная часть современных представлений об их свойствах, а также о взаимоотношении с представителями других групп организмов получена при изучении чистых культур. Поэтому часто возникает необходимость выделить чистые культуры различных видов микроорганизмов из объектов внешней среды, когда они тесно сосуществуют в естественных условиях с микробами других видов, родов, семейств, групп и отделов.
Микробиологи для этих целей используют в качестве одного из основныхметод накопительных культур. называются культуры, в кото-
рых преобладает одна группа или даже один вид микроорганизмов. представляет собой основной этап процесса, который в конечном итоге позволяет получить чистые культуры. Оно также дает возможность оценить различные воздействия факторов окружающей среды на смешанную микробную популяцию, благодаря которым может происходить отбор микроорганизмов, способных взаимодействовать со специфическими субстратами или способных хорошо расти в необычных условиях. Для получения накопительных культур создают элективные условия, обеспечивающие преимущественное развитие лишь данной группы или данного вида микроорганизмов и неблагоприятные для развития, сопутствующих форм микробов смешанной популяции.
Чистую культуру микроорганизма легко выделить, если он присутствует в смешанной популяции в достаточно высокой пропорции или даже преобладает количественно над другими видами, составляющими биоценоз смешанной популяции. Разработанные и используемые в микробиологии методы накопления имеют целью добиться увеличения относительного количества особей данного организма за счет создания лучших (элективных, избирательных) условий для их роста и выживания по сравнению с другими или путем пространственного отделения одного из микроорганизмов от других членов популяции. Элективные условия предусматривают ряд факторов, влияющих на жизнедеятельность микроорганизма; например: его потребность в определенном питательном субстрате, отношение к кислороду, кислотности среды, температуре выращивания, способности к образованию спор и т.д. О развитии накопительной культуры судят визуально по характерным признакам изменения питательной среды, образованию пленки, выделению пигмента, появлению мути, возникновению пузырьков газа, а также по микроскопии микроорганизма на прижизненных и постоянных микробиологических препаратах.
На основе накопительных культур далее выделяют чистые культуры микроорганизмов.
Получение накопительных культур различных таксономических групп проводят при использовании физических, химических и биологических методов.
К , которые могут быть использованы для получения накопительных культур, следует отнести: регуляцию роста температурой, тепловое одномоментное воздействие, ультразвуковую обработку и ультрафиолетовое
облучение, приводящих избирательно к гибели или подавлению роста других микроорганизмов, присутствующих в популяции. Можно также использовать преимущества изучаемого микроорганизма в некоторых физических свойствах, таких, как его размеры и подвижность.
В используют токсичные вещества, антибиотики, химиопрепараты, которые подавляют рост или убивают большинство микробов находящихся в исследуемой популяции, не оказывая существенного влияний на выделяемый микроорганизм.
включают использование специфических чувствительных хозяев (животных), которые служат биофильтром для всей исследуемой популяции микроорганизмов. Данный способ используют в большей степени при работе с патогенными микроорганизмами, которые за счет своих свойств(инва-
зивность, токсигенность и др.) получают преимущества при развитии в организме чувствительных животных.
Во многих случаях для получения максимального эффекта накопления используют сочетания физических, химических и биологических методов.
Как правило, накопительные культуры получают в закрытых системах, т.е. микроорганизмы выращивают в обычных периодических(стационарных) условиях в колбах или пробирках, где концентрация питательных веществ и продуктов метаболизма постоянно меняется в процессе их роста. Для получения накопительных культур также используются открытые системы. Например, с помощью хемостата можно обеспечить постоянство окружающей среды для бактерий, непрерывно подавая питательные вещества в концентрации, лимитирующей рост, и удаляя продукты метаболизма. Изменяя скорость разбавления среды в хемостате, можно контролировать концентрацию питательных веществ, лимитирующих рост. В свою очередь это может избирательно влиять на скорость роста различных микроорганизмов в смешанной культуре, в результате чего один из микроорганизмов смешанной популяции начинает количественно преобладать.
Из накопительных культур бактерии обычно выделяют путем их отделения на плотных питательных средах, используя специальные методы рассева (например, по способу Дригальского). Для микроорганизмов, не растущих на твердых средах, можно использовать метод предельного разведения, последовательно перенося исследуемую культуру из пробирки в пробирку с питательной средой.
Обычно используют пятикратные или десятикратные разведения.
Получение накопительной культуры сульфатредуцирующих бактерий
Освоить методику получения накопительных культур
Изучить характер роста культур сульфатредуцирующих бактерий
Описать морфологию сульфатредуцирующих бактерий
Вопросы для самоконтроля
Определение понятия «накопительная культура», методы её получения
Последовательность реакций в цикле серы
Состав среды Постгейта
Особенности метаболизма сульфатредуцирующих облигатных анаэробов
Состав конечных продуктов процесса сульфатредукции
Основные части микроскопа, их назначение и устройство
Способы фиксации микропрепарата
Порядок установки света на микроскопе
Восстановление сульфатов микроорганизмами может иметь разное значение. Большое число видов способны использовать сульфаты как источник серы. Это требует восстановления SOдо S, необходимой для биосинтеза серосодержащих органических веществ клеток. Такой процесс носит название .
Известен также ряд бактерий, которые используют сульфат в качестве конечного акцептора электронов при анаэробном дыхании. Этот процесс, ведущий к накоплению в среде сероводорода, называют или сульфатным дыханием, а бактерии, его осуществляющие, — сульфатредуцирующими. К числу сульфатредуцирующих бактерий относится значительное число анаэробных бактерий с разной морфологией. Среди них есть гетеротрофные и автотрофные виды. Некоторые из них способны не только к сульфатному дыханию, но и к брожению.
Для получения накопительной культуры сульфатредуцирующих бактерий
Раствор 2 (г): FeSO7HO — 0,5; дистиллированная вода — 10 мл.
Раствор 3 (г): аскорбиновая кислота — 0,1; Na-тиогликолят — 0,1; рН 7,4, дистиллированная вода — 10 мл.
Растворы стерилизуют отдельно, затем их сливают и разливают по стерильным пробиркам до самого верха.
Материалы и оборудование
КНР0; NНCl; CaCl2HO; MgSO7HO; FeSO7HO; лактат Na (70%
раствор); дрожжевой экстракт; аскорбиновая кислота; Na-тиогликолят; дистиллированная вода.
Образец почвы; парафин; резиновые или притертые пробки; пробирки; термостат.
Микроскопы, предметные и покровные стёкла.
Получить накопительную культуру сульфатредуцирующих бактерий. Описать характер роста.
Приготовить фиксированный препарат.
Микроскопировать с объективом 90х. Зарисовать.
Рисунок – Цикл превращения серы:
Среду Постгейта в стерильных пробирках инокулируют почвой(лучше болотной). Пробирки закрывают резиновыми или притертыми пробками и заливают парафином. Инкубируют в течение 20 — 25 дней при 30°С.
Развитие сульфатредуцирующих бактерий регистрируют по почернению осадка в пробирках вследствие образования сернистого железа.
Материалы, представляемые в отчёте
Название и цели работы
Описание характера процессов, протекающих в процессе сульфатредукции
Зарисовка и описание морфологии сульфатредуцирующих бактерий
Г. Шлегель. Общая микробиология. – М., Мир, 1987. С. 352 — 355
М.В. Гусев, Л.А. Минеева. Микробиология, 4-изд. — М.:»Академия», 2003. С. 370 – 375
Градова Н.Б., Бабусенко Е.С. Лабораторный практикум по общей микробио-
Лекции по разделу «Микроорганизмы как биогеохимические объекты»
олучение накопительных культур микроорганизмов, разрушающих целлюлозу (клетчатку)
Изучить характер роста культур целлюлозоразрушающих бактерий
Изучить процесс разложения целлюлозы до глюкозы и её дальнейшее превращение в аэробных и анаэробных условиях
Описать морфологию целлюлозоразрушающих бактерий
Состав питательных сред Гетчинсона и Имшенецкого
Пути и продукты разложения целлюлозы в аэробных и анаэробных условиях
Особенности метаболизма бактерий рода
Классификация питательных сред по консистенции
Техника посева на жидкие и полужидкие среды
Методы определения биологической концентрации
Техника приготовления препарата «висячая капля»
Техника приготовления препарата «раздавленная капля»
Приготовление мазка и его фиксация
Окраска по Граму
Наиболее распространенным углеводным соединением в природе является целлюлоза. Целлюлоза составляет от 15 до 60% массы растений, в хлопке и льне содержание целлюлозы достигает 80-95%.
Разложение целлюлозы микроорганизмами является самым большим по масштабам естественным деструкционным процессом, звеном круговорота углерода, обеспечивающим возврат фиксированного в процесс фотосинтеза углерода в атмосферу в виде СО.
Глобальная роль микроорганизмов в этом процессе определяется тем, что ни животные, ни растения, как правило, не способны разлагать целлюлозу. Трансформация целлюлозосодержащих соединений в природе происходит в разных условиях аэрации, температуры, рН среды.
природе разложение целлюлозы– это сложный, комплексный процесс, происходящий при участии сообщества микроорганизмов, в состав которого входят микроорганизмы, разлагающие целлюлозу, и микроорганизмы — спутники, использующие продукты распада.
анаэробных условиях разложение целлюлозы осуществляется анаэробными бактериями рода . При этом образуются различные органические кислоты (уксусная, янтарная, молочная, масляная, муравьиная), этиловый спирт, углекислый газ и водород.
отличие от процесса анаэробного разложения целлюлозы, который осуществляется только бактериями, в аэробных условиях клетчатку разлагают многие микроорганизмы разных систематических групп: бактерии, миксобактерии, актиномицеты, грибы.
кислых лесных почвах главная роль в превращении целлюлозы принадлежит грибам (p. и др., базидиальные грибы).
почвах под травянистой растительностью, в степных и луговых ландшафтах в разложении целлюлозы, помимо грибов, участвуют миксобактерии, актиномицеты, вибрионы p..
Разложение целлюлозы до глюкозы микробными ферментами протекает в несколько стадий и требует участия сложного ферментного комплекса, включающего не менее четырех ферментов (см. схему).
Эндоглюканаза и/или экзоцеллобиогидролаза
В анаэробных условиях глюкоза сбраживается в основном по типу маслянокислого брожения. В аэробных условиях глюкоза окисляется микроорганизмами до оксикислот, а затем до конечных продуктов – углекислого газа и воды.
Для получения накопительной культуры целлюлозоразрушающих аэробных бактерий используют (г/л): КНРО– 0,1; NaCl – 0,1; CaCl
– 0,1; FeCl– 0,1; MgSO7HO – 0,3; NaNO– 2,5; агар-агар – 2%.
Для получения накопительной культуры анаэробных целлюлозоразрушающих бактерий используют среду Имшенецкого: мясо-пептонный бульон – 500 мл; СаСО– 2 г, фильтровальная бумага – 15 г; водопроводная вода – 0,5 л.
Стерильные пробирки, стерильные фарфоровые чашки, резиновые перчатки. Чашки Петри и пробирки с питательной средой, стеклянные палочки, экси-
катор, фильтровальная бумага.
Микроскопы (Биолам Р-11, Биолам Р-15), предметные и покровные стекла, спиртовки, петли бактериологические.
Получить накопительную культуру целлюлозоразрушающих аэробных микроорганизмов. Подсчитать относительное количество целлюлозоразрушающих бактерий в почве. Описать морфологию их колоний. Описать морфологическое разнообразие клеток выросших микроорганизмов. Приготовить препараты «раздавленная капля». Микроскопировать с объективом 40х.
Получить накопительную культуру целлюлозоразрушающих анаэробных микроорганизмов. Описать характер протекающих процессов. Приготовить фиксированный препарат, окрашенный фуксином, микроскопировать с объективом 20х. Описать и зарисовать морфологию анаэробных целлюлозоразрушающих микроорганизмов.
Получение накопительной культуры целлюлозоразрушающих бактерий.
Среду Гетчинсона разливают в чашки Петри и на поверхность накладывают стерильную фильтровальную бумагу, вырезанную по размеру чашки Петри.
Образцы почвы помещают в стерильные пробирки, непосредственно в месте их сбора. Для разрушения почвенных агрегатов используют метод растирания почвы, увлажненной до пастообразного состояния в течение5 минут в стерильной фарфоровой чашке резиновыми пестиками или пальцем в резиновой перчатке.
Стеклянной палочкой с оттянутым концом на поверхность фильтра раскладывают параллельными рядами комочки почвы на расстоянии1 см (по трафарету). Засеянные чашки Петри помещают в эксикатор над водой и ставят в термостат при 25-30С.
Через 10-14 суток вокруг комочков почвы развиваются колонии целлюлозоразрушающих микроорганизмов в виде желтых, зеленых, оранжевых и коричневых пятен. В местах образования колоний фильтровальная бумага разлагается, ослизняется, становится прозрачной. По морфологии можно дифференцировать колонии плесневых грибов, актиномицетов и бактерий. Принимая общее число высеянных комочков за100%, можно подсчитать в процентах число комочков почвы, давших колонии целлюлозоразрушающих микроорганизмов. Из зон разрушения клетчатки готовят препарат«раздавленная капля» и описывают выделенные различные целлюлозоразрушающие микроорганизмы.
Получение накопительной культуры анаэробных целлюлозоразрушающих бактерий
Среду Имшенецкого разливают высоким слоем в высокие пробирки. На дно опускают нарезанную полосками фильтровальную бумагу. Пробирки закрывают ватными пробками, затем содержимое пробирок стерилизуют и засевают комочком почвы. Инкубируют в течение 10-14 суток в термостате при30-35С для обнаружения мезофильных бактерий и при60С – для поиска термофильных бактерий.
